论文解读丨Nat Commun：使用组织透明化技术无损研究类器官三维结构和细胞分布

论文解读丨Nat Commun：使用组织透明化技术无损研究类器官三维结构和细胞分布

研究的主要结果

1、模型构建：多腔室胆道类器官（MBOs）的构建与验证 将正常肝或 BA 患者肝来源的胆管上皮类器官细胞，与HUVECs（人脐静脉内皮细胞）、MSCs（间充质干细胞）按特定比例（胆管上皮细胞 4.7×10⁵个、HUVECs 3.3×10⁵个、MSCs 1.0×10⁵个）混合，接种于基底膜提取物（BME）与内皮细胞培养基（EGM）的混合基质中，先经扩张培养基（EM）培养 5 天，再用胆管分化培养基（DM）培养 9 天，最终形成3D 结构的 MBOs（图1）。

图 1 MBO(多腔室胆道类器官)的构建与检测

a：MBO 构建步骤示意图（含细胞混合、扩张培养、分化培养阶段）；

b-c：培养 5 天、10 天、14 天后 MBOs 外层细胞层面积量化结果（5-10 天外层细胞层面积增长 4 倍）及相位差显微镜下结构变化；

d-e： 整体免疫染色显示 MBOs 中 CK19⁺上皮细胞（红色）、CD31⁺内皮细胞（绿色）、VIM⁺间充质细胞（白色）的分布，与 3 日龄小鼠肝外胆管解剖结构高度一致；

g-h：PEGASOS 透明化处理后，免疫染色显示 MBO 与 3-4 日龄小鼠肝外胆管中 EPCAM（白色）和 TROP2（红色）的表达（MBO 中 PBGs 呈 TROP2 低表达 / EPCAM⁺）；

i：FACS 分析结果（MBO 中 TROP2 低表达 / EPCAM⁺的 PBG 细胞数量是单一上皮类器官（Mono）的 30 倍）；

j：免疫染色显示 MBOs 中 SOX9（红色）、SOX2（红色）、CK19（绿色）和细胞核（蓝色；DAPI）的信号分布（PBG 样结构表达 SOX9、SOX2 等祖细胞标志物）。 通过透明化后的 3D 成像，清晰观察到
NC-MBOs（正常 MBOs）的分层结构：外层 CK19⁺上皮细胞形成连续的胆管样结构，中央 CD31⁺内皮细胞和 VIM⁺间充质细胞形成支持网络，PBGs（胆管周围腺体）嵌入其中。对照实验显示，仅胆管上皮细胞与 MSCs 共培养无法形成完整 MBO 结构，仅与 HUVECs 共培养则无法形成类器官，证实内皮细胞和间充质细胞对 MBO 构建及 PBG 发育的必要性。

2、机制发现：BA-MBOs 中 EMT 与 TGF-β 信号的异常激活

为解析 BA 的核心致病机制，研究通过单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）对 BA-MBOs（BA 患者来源 MBOs）与 NC-MBOs 进行对比分析，结果如下： 1.异常中间细胞群富集：BA-MBOs 中存在 3 个异常富集的 “中间细胞群”（Intermediate 1/2/4），分别高表达 TGF-β 诱导 EMT 的介导基因（如 LGALS1、IGFBP7）、ECM 重塑基因（如 LOX、FN1），且是 TGF-β 的主要分泌来源； 2.TGF-β3 信号过度激活：BA-MBOs 中间充质细胞分泌的 TGF-β3 量是 NC-MBOs 的 4 倍，可通过激活上皮细胞的 SMAD2/3 通路，上调 SNAI1、ZEB2 等 EMT 转录因子； 3.上皮细胞表型异常：EMT 激活导致 BA-MBOs 中上皮细胞失去极性，形成 “pan-CK⁺/VIM⁺混合细胞”，上皮极性标志物 ZO1、E - 钙黏蛋白表达分布异常，酸性黏蛋白分泌能力显著下降（Alcian Blue 染色阳性率仅为 NC-MBOs 的 1/5）。

图 2 对类器官细胞的谱系分析

a-b：BA-MBO 与 NC-MBO 的相位差显微镜图像及 CK19⁺上皮细胞数量量化（BA-MBOs 中 CK19⁺细胞数量减少 40%）；

c：免疫染色对比两种类器官的 TGF-β3 表达（BA-MBOs 中 TGF-β3 染色强度是 NC-MBOs 的 4 倍）；

d：第 5 天和第 14 天 MBO 的 FACS 结果（第 14 天 BA-MBOs 中 pan-CK⁺/VIM⁺混合细胞数量是 NC-MBOs 的 2 倍，pan-CK⁺/VIM⁻上皮细胞数量减少 3 倍）；

e：scRNA-seq 的 UMAP 图（按细胞类型着色，含上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞及 5 个中间细胞群）；

f：中间细胞群的 MSigDB 通路富集结果（EMT、TGF-β 受体信号通路显著富集）；

g：各细胞群在 MBO 中的比例（BA-MBOs 中 Intermediate 2/4 细胞群占比增加 2-3 倍）；

h：UMAP 图中叠加的 EMT 评分（BA-MBOs 中中间细胞群 EMT 评分显著高于 NC-MBOs）。 长期培养实验显示，将 MBOs 培养至
28 天时，NC-MBOs 仍维持完整上皮结构，而 BA-MBOs 中 VIM⁺细胞进一步扩张，上皮细胞体积减少约 3 倍，再现了 BA 患者胆道纤维化的进展特征。

3、治疗探索：TGF-β 抑制剂对 BA 表型的逆转作用既往恐惧经历促进后续厌恶学习

体内外实验验证
TGF-β 抑制剂 A8301
对 BA 表型的逆转效果，具体结果如下：

1.体外实验（BA-MBOs）：

（1）10μM A8301 处理后，BA-MBOs 中 pan-CK⁺/VIM⁺混合细胞数量减少 60%，pan-CK⁺/VIM⁻上皮细胞数量增加 2 倍；

（2）透明化 3D 成像显示（图3C），上皮层连续性恢复，CK19⁺细胞形成的表面积与 NC-MBOs 无显著差异（p>0.05），PBGs 数量和大小分别增加 2.5 倍、3 倍；

（3）上皮功能恢复：ZO1、E - 钙黏蛋白重新定位于细胞顶端，酸性黏蛋白分泌能力恢复至 NC-MBOs 的 80%。

2.体内实验（BA 模型小鼠）： 对 RRV（恒河猴轮状病毒）感染诱导的 BA 模型小鼠，腹腔注射 A8301（1mg/kg 体重 / 天），结果显示：

（1）黄疸发生率从 80% 降至 25%，21 天存活率从 30% 提升至 75%；

（2）血清胆红素、谷丙转氨酶（ALT）水平分别降低 60%、55%；

（3）肝组织病理显示，肝外胆管上皮完整性恢复，门静脉区纤维化程度显著减轻（Sirius Red 染色阳性面积减少 50%）。

图 3 抑制TGF-β的表达对BA 表型存在恢复

作用 a：A8301 体外抑制 BA-MBOs 中 TGF-β 信号的流程示意图（含药物处理时间、浓度）；

b：FACS 定量第 14 天 A8301 处理后 MBOs 的胆管及间充质细胞数量；

c：A8301 处理后 ，PEGASOS透明化MBOs 的免疫染色图像（CK19：红，CD31：绿，VIM：白）及 CK19⁺结构数量、PBG 样结构大小定量；

d-f：A8301 处理后 BA-MBOs 的 E - 钙黏蛋白表达、ZO1 表达及 Alcian Blue 染色结果（黏液分泌能力显著恢复）；

g-h：BA 患者与正常对照血清中 TGF-β1/2/3 及 INHBA 的表达水平（BA 患者血清 TGF-β3 含量是正常对照的 3 倍）。

研究总结 该研究通过构建多腔室胆道类器官（MBOs）模型，首次在体外模拟了人类胆道的双重上皮结构（胆管上皮 + 胆管周围腺体），并明确了
TGF-β 介导的细胞间通讯在 BA 发病中的核心作用： 1.模型创新：MBOs 模型解决了传统单一上皮类器官无法模拟胆道微环境的局限，可用于 BA 发病机制研究及药物筛选； 2.机制突破：证实 TGF-β3-SMAD2/3-EMT 通路是 BA 胆道结构缺陷与纤维化的关键驱动通路； 3.治疗潜力：体内外实验证实 TGF-β 抑制剂 A8301 可有效逆转 BA 表型，为 BA 的靶向治疗提供了新方向。 该研究不仅为胆道疾病研究提供了更贴近生理状态的实验工具，也为 BA 的临床转化研究奠定了理论基础，未来有望通过 TGF-β 抑制剂联合其他疗法，改善 BA 患者的预后。